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Technique FISH


Le diagnostic :

Le diagnostic, souvent clinique, doit être validé par un examen sanguin appelé caryotype.
Le caryotype est habituellement normal s'il n'est pas accompagné d'une technique spécialisée :
La cytogénétique moléculaire : FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence).
Cette technique utilise des sondes spécifiques du gène de l'élastine.
L'hybridation fluorescente est une technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ utilisant des sondes marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent et utilisées sur des coupes en microscopie destinée à repérer la présence de molécules cibles par un système couplé anticorps-fluorophore.

Le principe :

La détection de séquences nucléotidiques sur une molécule d'ADN peignée sur une surface s'effectue indirectement, par hybridation des séquences d'ADN recherchées (les sondes) sur l'ADN peigné (ou ADN matrice ou cible). Si les sondes sont préparées de manière à incorporer des marqueurs fluorescents ou des sites de reconnaissance antigéniques ou autres, il est possible de visualiser par microscopie d'épifluorescence la position respective des sondes, ce qui constitue l'objectif de la cartographie physique.

Utilisée en médecine en association à la réalisation d'un caryotype, elle permet par exemple la recherche de microdélétions caractéristiques du syndrome de Williams ou du syndrome de Jacobsen. Elle permet de différencier un syndrome CHARGE d'un syndrome de microdélétion 22q11, tous deux résultants en des problèmes cardiaques.

Les sondes :

Les sondes elles-mêmes sont réalisées séparément suivant différents protocoles possibles, tous basés sur la reconstitution d'un brin d'ADN comportant des nucléotides modifiés, à partir d'un brin matrice de départ.

L'hybridation :

Sur une lame contenant des cellules en mitose, on effectue un pré-traitement par l'ARNase et la protéinase K afin de faciliter l'accès de la sonde vers les chromosomes.
On dénature ensuite l'ADN en chauffant les lames au bain-marie afin de séparer les deux brins d'ADN.
L'hybridation est l'étape de mise en présence des sondes avec les molécules d'ADN peignées. L'ADN cible est au préalable dénaturé, c'est-à-dire qu'il subit un traitement censé séparer partiellement les deux brins constitutifs de la molécule, découvrant ainsi des portions de simple brin.

Les sondes elles-mêmes sont également dénaturées, ce qui a pour résultat dans leur cas, de séparer complètement les monobrins.
Les sondes viennent alors spontanément s'apparier avec les séquences complémentaires présentes sur l'ADN peigné.

La révélation :

On applique la sonde marquée à la digoxigènine (sonde ONCOR DS7S427) qui marque le gène de l'élastine et une zone témoin du chromosome 7 située en 7q36.
La révélation est l'étape finale de l'hybridation fluorescente. Elle consiste à faire reconnaître les sondes par des anticorps flanqués de sites moléculaires fluorescents.

L'observation :

L'observation des séquences hybridées s'effectue à l'aide d'un microscope à épifluorescence, qui éclaire l'échantillon avec une lumière de longueur d'onde assez spécifique, et récupère la lumière émise par les sites fluorescents, en général de longueur d'onde supérieure, ce qui permet de n'observer que les sites hybridés.
Après une nuit d'incubation à 37°c, on procède au lavage des lames et on révèle la sonde grâce à un anticorps anti-digoxigènine marqué à la fluorescéine (FITC).

A l'aide de jeux de filtres optiques, il est ainsi possible d'observer plusieurs fluorophores aux caractéristiques optiques différentes, et donc de distinguer entre sondes hybridées sur le même brin d'ADN.

Les chromosomes normaux sont marqués par quatre spots (deux spots témoins du chromosome 7 et deux spots témoins du gène de l'élastine).
Sur les chromosomes délétés, on ne remarque que trois spots (deux spots témoins du chromosome 7 et un seul spot témoin du gène de l'élastine).
La sonde spécifique du locus du gène de l'élastine est marquée par un chromogène. Si le gène est présent, des signaux positifs apparaissent sous forme de petites taches fluorescentes disposées sur les deux allèles du chromosome 7.
L'absence d'un des deux spots fluorescents signe la perte de l'hétérozygotie du locus de l'élastine.
Pour réaliser cette technique, le choix de la sonde est fondamental et permet de retrouver une délétion dans 90 à 96 % des cas.